Characterization of hepatitis B virus X gene quasispecies complexity in mono-infection and hepatitis delta virus superinfection

Hepatitis B X gene; Hepatitis B virus; Hepatitis delta virusHepatitis B gen X; Virus d'hepatitis B; Virus d'hepatitis deltaHepatitis B gen X; Virus de hepatitis B; Virus de hepatitis deltaBACKGROUND: Hepatitis delta virus (HDV) seems to strongly suppress hepatitis B virus (HBV) replication, although little is known about the mechanism of this interaction. Both these viruses show a dynamic distribution of mutants, resulting in viral quasispecies. Next-generation sequencing is a viable approach for analyzing the composition of these mutant spectra. As the regulatory hepatitis B X protein (HBx) is essential for HBV replication, determination of HBV X gene (HBX) quasispecies complexity in HBV/HDV infection compared to HBV mono-infection may provide information on the interactions between these two viruses. AIM: To compare HBV quasispecies complexity in the HBX 5' region between chronic hepatitis delta (CHD) and chronic HBV mono-infected patients. METHODS: Twenty-four untreated patients were included: 7/24 (29.2%) with HBeAg-negative chronic HBV infection (CI, previously termed inactive carriers), 8/24 (33.3%) with HBeAg-negative chronic hepatitis B (CHB) and 9/24 (37.5%) with CHD. A serum sample from each patient was first tested for HBV DNA levels. The HBX 5' region [nucleotides (nt) 1255-1611] was then PCR-amplified for subsequent next-generation sequencing (MiSeq, Illumina, United States). HBV quasispecies complexity in the region analyzed was evaluated using incidence-based indices (number of haplotypes and number of mutations), abundance-based indices (Hill numbers of order 1 and 2), and functional indices (mutation frequency and nucleotide diversity). We also evaluated the pattern of nucleotide changes to investigate which of them could be the cause of the quasispecies complexity. RESULTS: CHB patients showed higher median HBV-DNA levels [5.4 logIU/mL, interquartile range (IQR) 3.5-7.9] than CHD (3.4 logIU/mL, IQR 3-7.6) (P = n.s.) or CI (3.2 logIU/mL, IQR 2.3-3.5) (P < 0.01) patients. The incidence and abundance indices indicated that HBV quasispecies complexity was significantly greater in CI than CHB. A similar trend was observed in CHD patients, although only Hill numbers of order 2 showed statistically significant differences (CHB 2.81, IQR 1.11-4.57 vs CHD 8.87, 6.56-11.18, P = 0.038). There were no significant differences in the functional indices, but CI and CHD patients also showed a trend towards greater complexity than CHB. No differences were found for any HBV quasispecies complexity indices between CHD and CI patients. G-to-A and C-to-T nucleotide changes, characteristic of APOBEC3G, were higher in CHD and CI than in CHB in genotype A haplotypes, but not in genotype D. The proportion of nt G-to-A vs A-to-G changes and C-to-T vs T-to-C changes in genotype A and D haplotypes in CHD patients showed no significant differences. In CHB and CI the results of these comparisons were dependent on HBV genotype. CONCLUSION: The lower-replication CHD and CI groups show a trend to higher quasispecies complexity than the higher-replication CHB group. The mechanisms associated with this greater complexity require elucidation.Supported by the Instituto de Salud Carlos III, grants PI15/00856 and PI17/02233; co-financed by the European Regional Development Fund (ERDF

Estudio de la quasiespecies del virus de la hepatitis delta: análisis de la región del antígeno delta y de la ribozima

El virus de l’hepatitis delta (VHD) es un virus d’ARN que requereix de l’antigen de superfície del virus de l’hepatitis B (HBsAg) per completar el seu cicle replicatiu. Aquest virus es l’agent etiològic de l’hepatitis delta, la forma més greu d’hepatitis viral en humans, que s’estima que afecta un total de 15 a 20 milions de persones en tot el món. El genoma del VHD es una molècula d’ARN d’una sola cadena, circular, al voltant de 1700 nucleòtids i de polaritat negativa. Aquest genoma codifica solament una proteïna, l’antigen delta (HDAg), que té dos isoformes (la llarga i la curta) generades gracies a una modificació postranscripcional (desaminació) durant la replicació viral, que canvia el codó 196 de stop (TAG) a l’aminoàcid W (TGG). Aquest procés també es coneix com edició i està catalitzat per la adenosina desaminasa que actua sobre ARN 1 (ADAR-1). A més a més el genoma conte un domini amb activitat enzimàtica capaç de processar al propi genoma (autoescisió), essencial per la replicació viral, la ribozima. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha sigut estudiar la quasiespècies del VHD mitjançant seqüenciació massiva (NGS), analitzant la conservació o variabilitat de les regions funcionals del virus, corresponents al HDAg (quantificació de la seva edició) y a la ribozima. En el primer estudi es va incloure una mostra de plasma de 4 pacients amb hepatitis delta crònica, per validar la quantificació de percentatges de poblacions de genomes editats i no editats per NGS, comparant-la amb la metodologia de seqüenciació Sanger dels productes de la clonació. A més a més, es va estudiar la precisió i la sensibilitat de la NGS, utilitzant barreges de diferents proporcions de productes de clonació editats i no editats, i es van observar els patrons de canvis nucleotídics per analitzar si l’edició es un fenomen general que té lloc a tota la regió codificant del HDAg analitzada. Per altra banda, en el segon estudi es van incloure 36 mostres de plasma de 12 pacients amb hepatitis delta crònica y es va analitzar el grau de conservació o variabilitat de la quasiespècies en les regions analitzades del HDAg i de la ribozima. A més a més es va determinar l’existència de patrons de mutacions a nivell aminoacídic en el HDAg. Mitjançant els resultats obtinguts s’ha demostrat que la NGS es una metodologia útil per detectar proporcions de genomes del VHD editats i no editats, més sensible i precisa que la seqüenciació Sanger dels productes de clonació. També s’ha observat que el fenomen d’edició en la regió codificant del HDAg podria no ser exclusiu de la posició d’edició. A més a més els resultats van mostrar que la regió del HDAg es variable i que els patrons de mutacions aminoacídiques generalment podrien estar relacionats amb l’escapament del sistema immunitari, possiblement sense afectar significativament la funcionalitat de les regions del HDAg on es troben. Per últim, s’ha observat que la regió de la ribozima conté un elevat nivell de conservació a la seva seqüència.El virus de la hepatitis delta (VHD) es un virus de ARN que requiere del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) para completar su ciclo replicativo. Este virus es el agente etiológico de la hepatitis delta, la forma más grave de hepatitis viral en humanos, que se estima que afecta un total de 15 a 20 millones de personas en todo el mundo. El genoma del VHD es una molécula de ARN de una sola hebra, circular, de alrededor de 1700 nucleótidos y de polaridad negativa. Este genoma codifica tan solo una proteína, el antígeno delta (HDAg), que tiene dos isoformas (la larga y la corta) generadas gracias a una modificación postranscripcional (desaminación) durante la replicación viral, que cambia el codón 196 de stop (TAG) al aminoácido W (TGG). Este proceso también se conoce como edición y está catalizado por la adenosina desaminasa que actúa sobre ARN 1 (ADAR-1). Además el genoma contiene un dominio con actividad enzimática capaz de procesar al propio genoma (autoescisión), esencial para la replicación viral, la ribozima. El objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar la quasiespecies del VHD mediante secuenciación masiva (NGS), analizando la conservación o variabilidad de las regiones funcionales del virus, correspondientes al HDAg (cuantificando su edición) y a la ribozima. En el primer estudio se incluyó una muestra de plasma de 4 pacientes con hepatitis crónica delta, para validar la cuantificación de porcentajes de poblaciones de genomas editados y no editados por NGS, comparándola con el método de secuenciación Sanger de los productos de clonación. Además, se estudió la precisión y sensibilidad de la NGS, utilizando mezclas de diferentes proporciones de productos de clonación editados y no editados, y se observaron los patrones de cambios nucleotídicos para analizar si la edición es un fenómeno general que tiene lugar en toda la región codificante del HDAg analizada. Por otro lado, en el segundo estudio se incluyeron 36 muestras de plasma de 12 pacientes con hepatitis crónica delta y se analizó el grado de conservación o variabilidad de la quasiespecies en las regiones analizadas del HDAg y de la ribozima. Además se determinó la existencia de patrones de mutaciones a nivel aminoacídico en el HDAg. Mediante los resultados obtenidos se ha demostrado que la NGS es un método útil para detectar proporciones de genomas del VHD editados y no editados, más sensible y preciso que la secuenciación Sanger de los productos de clonación. También se ha observado que el fenómeno de edición en la región codificante del HDAg podría no ser exclusivo de la posición de edición. Además, los resultados mostraron que la región del HDAg es variable y que los patrones de mutaciones aminoacídicas generalmente podrían estar relacionados con el escape al sistema inmunitario, posiblemente sin afectar significativamente la funcionalidad de las regiones del HDAg donde se encuentran. Por último, se ha observado que la región de la ribozima contiene un elevado nivel de conservación en su secuencia nucleotídica.Hepatitis delta virus (HDV) is an RNA virus that requires the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) to complete its replicative cycle. This virus is the etiological agent of delta hepatitis, the most severe form of viral hepatitis in humans, which is estimated to affect a total of 15 to 20 million people worldwide. The HDV genome is around 1700 nucleotides, single-stranded, circular and negative polarity RNA molecule. This genome encodes just one protein, the delta antigen (HDAg), which has two isoforms (the large one and the short one) generated by post-transcriptional modification (deamination) during viral replication. This modification changes the stop codon 196 (TAG) into the W amino acid (TGG). This process is also known as editing and is catalyzed by adenosine deaminase that acts on RNA 1 (ADAR-1). Furthermore, the genome contains a domain with enzymatic activity capable of processing the genome itself (self-cleaving), essential for viral replication: the ribozyme. The main objective of this thesis has been to study the HDV quasispecies by next generation sequencing (NGS), analyzing the conservation or variability of the functional regions of the virus, corresponding to HDAg (quantifying its edition) and the ribozyme. In the first study, a plasma sample from 4 patients with chronic hepatitis delta was included to validate the quantification of percentages of edited and unedited genome populations by NGS and it was compared with the Sanger sequencing method of cloning products. In addition, the accuracy and sensitivity of NGS were studied, using mixtures of different percentages of edited and unedited cloning products, and nucleotide change patterns were also analyzed to confirm whether editing is a general phenomenon taking place along the entire coding region of the analyzed HDAg. On the other hand, 36 plasma samples from 12 patients with chronic hepatitis delta were included in the second study, and the conservation or variability of quasispecies in the analyzed regions of HDAg and ribozyme was analyzed. Furthermore, the existence of amino acid mutation patterns in HDAg was determined. The obtained results showed that NGS is a useful method to detect proportions of edited and unedited HDV genomes, more sensitive and accurate than Sanger sequencing of cloning products. It has also been observed that the editing phenomenon taking place along the entire HDAg coding region analyzed may not be unique to the editing position. Furthermore, the results showed that the HDAg region is variable and that amino acid mutation patterns could generally be related to escape from immune system, possibly without significantly affecting the functionality of the HDAg regions where they are found. Finally, it has been observed that the ribozyme region contains a high level of conservation in its nucleotide sequence.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicin